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Nota Técnica:
Cómo comprar un Espectrofotómetro UV-Visible

La primera etapa del proceso de Calificación de Equipos (EQ) es la Calificación de Diseño (DQ), en la que el usuario debe establecer las especificaciones funcionales y operacionales del instrumento a adquirir; en base a sus necesidades analíticas y a la oferta del mercado debe decidir cuál es el equipo más adecuado. Por otro lado, la diversidad de la oferta actual en todas las áreas de la instrumentación analítica y los continuos avances tecnológicos hacen que a veces la elección sea muy difícil.

Aún en el caso de un equipo común y relativamente simple como un espectrofotómetro ultravioleta-visible las opciones son tantas que la elección no es sencilla: además de contestar las preguntas básicas como rango espectral y fotométrico, exactitud y repetibilidad, se nos presentan otras como ¿simple o doble haz?; ¿convencional o por arreglo de diodos?; ¿detector de estado sólido o fotomultiplicador?; ¿ranura fija o variable?; ....

Luego, cuando comparamos especificaciones de los fabricantes, encontramos parámetros en los que ni siquiera habíamos pensado, como el nivel de rechazo de luz espuria, la distancia focal del monocromador, el número de líneas de la red de difracción, su dispersión lineal recíproca, su ángulo de “blaze”, etc.

Algunos de estos parámetros son fundamentales para hacer una elección adecuada y por lo tanto debemos conocerlos, pero otros no aportan más que confusión al usuario, que puede ser un experto en su trabajo pero no necesariamente en las herramientas que necesita para el mismo.

El objetivo de esta serie de artículos es analizar para cada tipo de instrumento cuáles son los parámetros más importantes que hay que tener en cuenta, cuáles son menos importantes, y en algunos casos cuáles es aconsejable ignorar porque sólo aportan confusión.

COMO COMPRAR EL “MEJOR” ESPECTROFOTÓMETRO UV-VISIBLE.

En primer lugar deberíamos estar de acuerdo en que no existe el “mejor” equipo, en todo caso sólo el más adecuado para una necesidad y un presupuesto determinados.

El equipo ideal no existe, y el equipo real resulta de una larga serie de compromisos, en los que el costo es un parámetro importante. Un ejemplo: al aumentar la resolución en un espectrofotómetro disminuye la relación señal / ruido, con lo que disminuye la sensibilidad analítica.

Una solución es utilizar un detector más sensible, como un fotomultiplicador, pero además de ser mucho más caro que un detector de estado sólido requiere una fuente de alta tensión, también más cara y que aumenta el tamaño y la complejidad del equipo. El tema es que no todos los usuarios tienen las mismas necesidades: algunos requieren sólo alta sensibilidad, otros están más interesados en la resolución, y otros requieren alta sensibilidad y resolución al mismo tiempo.

Es obvio que un equipo de alta sensibilidad y resolución sería adecuado para todos, pero para qué tener un equipo más grande, complejo y caro, si no es necesario. Por suerte, hay equipos adecuados para cada uno de ellos.

En este artículo supondremos que el comprador ya sabe cuáles son sus necesidades en cuanto a rango espectral y fotométrico, y nos concentraremos en otras características y parámetros.

El espectrofotómetro convencional

Un espectrofotómetro convencional enfoca la luz policromática de la fuente en un monocromador. Este tiene como componentes principales una ranura de entrada, un elemento que dispersa la luz en sus longitudes de onda componentes (en general una red de difracción), y una ranura de salida que permite seleccionar la longitud de onda deseada.

Esa luz “monocromática” atraviesa la muestra, y llega al detector. Las mediciones fotométricas se hacen en base a la relación entre la potencia de luz que alcanza al detector cuando está interpuesta la muestra (P) y cuando no lo está (P₀) o cuando está interpuesto un “blanco”.

La transmitancia se define como T = P / P₀ y la absorbancia como A = - log T = - log P / P₀

La base de la espectrometría de absorción y su uso para el análisis cuantitativo está dada por la relación conocida como ley de Beer:

A_l = a_l . b. C

Donde
a_l es la absortividad, un coeficiente característico de la sustancia absorbente a cada longitud de onda l ,
b es la longitud del camino óptico (distancia que atraviesa la luz dentro de la muestra), y
C es la concentración de la sustancia absorbente.

En realidad el monocromador no selecciona una única longitud de onda, sino un rango, cuya amplitud depende de la calidad (resolución) del mismo. Esta resolución depende fundamentalmente del diseño (montaje) del monocromador, de su distancia focal y de las dimensiones y densidad de líneas en la red de difracción.

Para cambiar la longitud de onda de medición, o para hacer un barrido espectral, se mueve el elemento dispersor o algún espejo por medio de un motor por pasos.

El espectrofotómetro de dispositivo de diodos

El espectrofotómetro de dispositivo de fotodiodos (diode array, mal traducido como arreglo de diodos) fue introducido a mediados de los ’70. Utiliza una óptica invertida respecto del convencional: toda la luz de la fuente atraviesa la muestra, luego es dispersada en un monocromador que en lugar de una ranura de salida tiene en el plano focal un dispositivo que integra en un pequeño circuito varios cientos de detectores tipo fotodiodo de silicio. El número de elementos varía actualmente entre 64 y 4096, siendo los más comunes de 512 y 1024 elementos.

Cada elemento del dispositivo recibe luz de un rango particular de longitudes de onda, y una computadora procesa los datos recibidos. Las principales ventajas del espectrofotómetro de dispositivo de fotodiodos son que para obtener un espectro no hace falta mover ningún elemento, y los espectros se obtienen en forma casi instantánea.

La tabla a continuación resume las principales ventajas y desventajas de cada tipo de espectrofotómetro:

	ESPECTROFOTOMETRO CONVENCIONAL		DISPOSITIVO DE FOTODIODOS (DAD)
EXACTITUD ESPECTRAL	Puede adquirir datos a intervalos de 0.1nm, por lo que tanto barridos espectrales como mediciones fotométricas pueden ser obtenidos con mayor exactitud.	J	El intervalo de muestreo es fijo, dado por el cociente entre el rango espectral total del instrumento y el número de elementos del DAD. En general es del orden de 1nm. Para datos a l intermedias usa interpolación.
REPETIBILIDAD ESPECTRAL	Espectros: para realizar barridos debe rotar la red o algún espejo, puede haber ligeras diferencias en barridos repetidos (más difícil en equipos modernos con motores por pasos controlados por microprocesador). En mediciones a l fija no tiene diferencias con el DAD.		Los componentes más importantes son estacionarios, adquiere datos a todas las l simultáneamente, con excelente repetibilidad	J
EXACTITUD FOTOMETRICA	Depende de la calidad del equipo, pero en general mayor que el de óptica invertida.	J	Interacciones no consideradas en la ley de Beer, que parte del supuesto que la muestra es iluminada con luz monocromática, degradan la exactitud fotométrica.
RESOLUCION	Puede ser fija o variable, en todo el rango espectral. Con un buen monocromador, puede alcanzar grados de resolución mucho mayores, por ejemplo 0.1nm	J	Limitada por el número de elementos del DAD. En general es de 1 ó 2 nm.
	Espectro de vapor de benceno obtenido con espectrofotómetro Shimadzu UV-2550, resolución 0.5 nm	J	Espectro de vapor de benceno obtenido con espectrofotómetro Shimadzu MultiSpec diode-array, resolución 1.5 nm
LUZ ESPURIA	Para eliminar órdenes superiores de la red, automáticamente se colocan filtros antes de la ranura de entrada, en función de la l . El rango dinámico que alcanzan los espectrofotómetros convencionales modernos está entre 1 y 4 A, hasta 6 ó 7 A usando dos monocromadores en serie.	J	En general la luz espuria es más alta debido a la óptica invertida (más posibilidades de que llegue luz poli-cromática al detector), por lo que la linealidad es menor. Los órdenes superiores de la red se eliminan con filtros colocados en forma fija sobre los elementos del dispositivo, con correcciones adicionales de fondo por software.
DERIVA	Corregida automáticamente en equipos de doble haz o de doble detector. Además puede compensar automáticamente y en una sola operación la absorción por parte del solvente o blanco de reactivos	J	Los equipos son de simple haz, por lo que no pueden medir y compensar las fluctuaciones (deriva) en el tiempo. Requiere una corrección inicial de fondo, y este procedimiento debe ser repetido periódicamente, sobre todo en caso de cambios de temperatura.
VELOCIDAD PARA MEDIR ESPECTROS	Aunque los equipos modernos pueden mover muy rápidamente la red o espejos, el barrido a velocidad muy alta puede dar picos deformados y con menor resolución y exactitud.		La mayor ventaja del dispositivo de diodos. Adquiere datos a todas las l simultáneamente y puede mostrar un espectro completo en menos de un segundo.	J
MEDICION SIMULTANEA A VARIAS l	Para medir a dos o más l debe mover la red o al menos un espejo. Por rápido que sea el movimiento, la medición no es simultánea.		Adquiere datos a todas las l simultáneamente.	J
DEGRADACIÓN DE MUESTRAS	Expone la muestra a poca radiación, sólo de la l de interés.	J	Expone la muestra a toda la radiación policromática de las lámparas, con alta probabilidad de degradación de muestras fotosensibles.
COMPARTIMIENTO DE MUESTRAS	Cerrado durante las mediciones, hay que abrirlo para el agregado de reactivos.		Las mediciones nos son afectadas por la luz ambiente, el compartimiento de muestras puede quedar abierto, facilitando el agregado de reactivos.	J

	ESPECTROFOTOMETRO CONVENCIONAL		DISPOSITIVO DE FOTODIODOS (DAD)
EXACTITUD ESPECTRAL	Puede adquirir datos a intervalos de 0.1nm, por lo que tanto barridos espectrales como mediciones fotométricas pueden ser obtenidos con mayor exactitud.	J	El intervalo de muestreo es fijo, dado por el cociente entre el rango espectral total del instrumento y el número de elementos del DAD. En general es del orden de 1nm. Para datos a l intermedias utiliza interpolación.
REPETIBILIDAD ESPECTRAL	Espectros: para realizar barridos debe rotar la red o algún espejo, puede haber ligeras diferencias en barridos repetidos (más difícil en equipos modernos con motores por pasos controlados por microprocesador). En mediciones a l fija no tiene diferencias con el DAD.		Los componentes más importantes son estacionarios, adquiere datos a todas las l simultáneamente, con excelente repetibilidad	J
EXACTITUD FOTOMETRICA	Depende de la calidad del equipo, pero en general mayor que el de óptica invertida.	J	Interacciones no consideradas en la ley de Beer, que parte del supuesto que la muestra es iluminada con luz monocromática, degradan la exactitud fotométrica.
RESOLUCION	Puede ser fija o variable, en todo el rango espectral. Con un buen monocromador, puede alcanzar grados de resolución mucho mayores, por ejemplo 0.1nm	J	Limitada por el número de elementos del DAD. En general es de 1 ó 2 nm.
	Espectro de vapor de benceno obtenido con espectrofotómetro Shimadzu UV-2550, resolución 0.5 nm		Espectro de vapor de benceno obtenido con espectrofotómetro Shimadzu MultiSpec diode-array, resolución 1.5 nm
LUZ ESPURIA	Para eliminar órdenes superiores de la red, automáticamente se colocan filtros antes de la ranura de entrada, en función de la l . El rango dinámico que alcanzan los espectrofotómetros convencionales modernos está entre 1 y 4 A, hasta 6 ó 7 A usando dos monocromadores en serie.	J	En general la luz espuria es más alta debido a la óptica invertida (más posibilidades de que llegue luz policromática al detector), por lo que la linealidad es menor. Los órdenes superiores de la red se eliminan con filtros colocados en forma fija sobre los elementos del dispositivo, con correcciones adicionales de fondo por software.
DERIVA	Corregida automáticamente en equipos de doble haz o de doble detector. Además puede compensar automáticamente y en una sola operación la absorción por parte del solvente o blanco de reactivos	J	Los equipos son de simple haz, por lo que no pueden medir y compensar las fluctuaciones (deriva) en el tiempo. Requiere una corrección inicial de fondo, y este procedimiento debe ser repetido periódicamente, sobre todo en caso de cambios de temperatura.
VELOCIDAD PARA MEDIR ESPECTROS	Aunque los equipos modernos pueden mover muy rápidamente la red o espejos, el barrido a velocidad muy alta puede dar picos deformados y con menor resolución y exactitud.		La mayor ventaja del dispositivo de diodos. Adquiere datos a todas las l simultáneamente y puede mostrar un espectro completo en menos de un segundo.	J
MEDICION SIMULTANEA A VARIAS l	Para medir a dos o más l debe mover la red o al menos un espejo. Por rápido que sea el movimiento, la medición no es simultánea.		Adquiere datos a todas las l simultáneamente.	J
DEGRADACIÓN DE MUESTRAS	Expone la muestra a poca radiación, sólo de la l de interés.	J	Expone la muestra a toda la radiación policromática de las lámparas, con alta probabilidad de degradación de muestras fotosensibles.
COMPARTIMIENTO DE MUESTRAS	Cerrado durante las mediciones, hay que abrirlo para el agregado de reactivos.		Las mediciones nos son afectadas por la luz ambiente, el compartimiento de muestras puede quedar abierto, facilitando el agregado de reactivos.	J

Resolución espectral

Para nuestro propósito, nos concentraremos en los aspectos prácticos, y aquí lo más importante es saber qué resolución necesitamos para nuestro trabajo, y esa resolución está expresada en general como ancho espectral del instrumento (spectral bandwidth).

Como regla general, el ancho de media banda instrumental debe ser como máximo 1/10 del ancho de media banda espectral de la banda de absorción a medir.

Dado que la mayoría de las moléculas en solución presentan en fase líquida bandas de absorción con anchos medios entre 20 y 40nm, un instrumento con “resolución” de 2nm es generalmente adecuado. A veces encontramos casos particulares (Ej.: cianocobalamina – vitamina B12) con bandas de anchos del orden de 10nm. En este caso, la cuantificación con un instrumento de 2nm daría un error por defecto del orden del 2-3%, mientras que con un equipo de 1nm de ancho de banda el error sería despreciable.

En el caso de medición de gases o vapores, las interacciones son menores y por lo tanto las bandas de absorción también, por lo que en general se requieren instrumentos de alta resolución (0,1nm).

Hay dos parámetros que afectan directamente la resolución de un monocromador: la densidad de líneas de la red y la distancia focal. La resolución es directamente proporcional a cada uno de estos parámetros. Sin embargo, al aumentar la densidad de líneas de la red aumenta la dispersión y disminuye la eficiencia reflectiva aparente, lo que se corrige aumentando el ancho de ranura (lo que disminuye la resolución). Aumentar la distancia focal también tiene su costo: el monocromador se hace más grande, disminuyen las tolerancias ópticas y mecánicas y las especificaciones para el alineamiento se hacen más estrictas.

Por supuesto también aumenta el precio.

Y aun si el precio no fuera un problema, no siempre es lo mejor un instrumento con la mayor resolución. Un importante costo a pagar con el aumento de la resolución es un deterioro en la sensibilidad: al aumentar la resolución, disminuye en proporción cuadrática la relación señal / ruido (y con ella la sensibilidad analítica). Por ejemplo: al disminuir a la décima parte el ancho de banda instrumental (digamos de 1nm a 0,1nm) la relación señal / ruido disminuye a la centésima parte. Esto es importante para tener en cuenta en los espectrofotómetros con ancho espectral variable.

Luz espuria (stray light)</